Sterilisasi
Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan-bahan dari segala macam bentuk kehidupan, termasuk mikroorganisme. Medium dan alat-alat yang kita pergunakan dalam inokulasi jika tidak steril, maka tidak akan mungkin memperoleh biakan bakteri yang diinginkan. Langkah pertama yang harus diambil sebelum mengadakan inokulasi adalah mensterilkan medium serta alat-alat perlengkapannya (Dwidjoseputro,1985). Setiap mikroorganisme mempunyai kerentanan berbeda terhadap bahan-bahan yang digunakan untuk mematikannya tergantung dari kadar air, pH lingkungan, umur sel atau spora dan lainnya. Menurut Hadioetomo (1985) cara untuk mensterilkan medium adalah menggunakan autoklaf, yaitu alat yang menyerupai tangki minyak di mana di dalamnya terdapat air untuk diuapkan. Medium tersebut dimasukan dalam autoklaf selama 15-20 menit.
2.2. Medium
Medium adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan mikroorganisme. Medium agar merupakan salah satu tehnik yang sangat baik untuk memisahkan mikroba sehingga dapat diketahui masing–masing (Fardiaz, 1989). Menurut Dwidjoseputro (1985) dasar makanan yang paling baik bagi pemeliharaan dan pembiakan bakteri adalah medium yang mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa-sisa makanan atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia.
2.3. Penanaman dan Isolasi Mikroba
Memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru membutuhkan banyak ketelitian. Menurut Hadioetomo (1985), semua alat yang berhubungan dengan medium dan inokulasi harus benar-benar steril, untuk menghindari kontaminasi yaitu masuknya mikroorganisme lain. Faktor utama yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba meliputi ketersediaan zat-zat makanan (nutrisi), suhu, air, pH dan tersedianya oksigen (Buckle et al. 1987).
Pewarnaan
Untuk yang pertama kalinya pada tahun 1884 oleh seorang bakteriologi Denmark, Christian Gram, memperlihatkan bakteri pneumokokus pada paru-paru pasien yang mati karena pneumonia. Pewarnaan pada mikroba ini dapat dilakukan dengan dua cara yaitu dengan pewarnaan sederhana yaitu menggunakan larutan tunggal methylen blue 0,1 % dan metode pewarnaan gram dengan 4 tahapan pewarnaan; yang terdiri dari pemberian larutan gram A yaitu kristal violet sebagai pewarnaan dasar, lalu larutan gram B yaitu iodium sebagai cat penguat, larutan gram C yaitu ethyl alkohol 95% sebagai peluntur cat dan larutan gram D safranin yang memberikan warna merah pada cat yang luntur (Cappucino, 1983). Metode pewarnaan gram dapat menghasilkan dua kemungkinan yakni pewarna gram negatif menghasilkan warna merah dan gram positif menghasilkan warna ungu-biru. Ada pula bakteri pada usia tertentu berubah dari gram positif menjadi gram negatif atau sebaliknya. Pewarnaan bakteri haruslah diambil dari suatu piaraan yang masih muda, kira-kira umur 24 jam karena baik untuk memperlihatkan bentuk morfologinya (Dwidjoseputro, 1985).
Buckle K.A, R.A Edward, G.G Fleet and M. Wooton. 1987. Ilmu Pangan. UI press. Jakarta. (Diterjemahkan oleh Heri Purnomo dan Adiono)
Fardiaz. 1989. Analisis Mikrobiologi Pangan. PAU Pangan dan Gizi IPB, Bogor.
Cappucino, J. G. dan Natalie S. 1983. Microbiology : A. Laboratory Manual. Addison wesley Publishing Companey, Sydney.